熒光光譜技術(shù)是一種通過(guò)測(cè)量物質(zhì)吸收光后發(fā)射的熒光光譜來(lái)研究物質(zhì)性質(zhì)的技術(shù)。本文根據(jù)《JY-T 0571-2020》，簡(jiǎn)單總結(jié)了熒光光譜分析測(cè)試或分析方法原理。

?

1熒光定性定量分析原理

熒光分析主要是指利用某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光的激發(fā)下，產(chǎn)生特定波長(zhǎng)和特定強(qiáng)度熒光等的特性進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量的分析方法。

注：定量分析僅限于稀溶液樣品，一般不直接用于固體樣品定量分析。

1.1定性分析

常采用直接比較法，將樣品的激發(fā)和發(fā)射光譜峰的數(shù)目、位置、強(qiáng)度以及光譜形狀（極值和拐點(diǎn)）、發(fā)射光譜壽命等特征，與標(biāo)準(zhǔn)物的譜圖作比較，以確定物質(zhì)種類(lèi)。

1.2定量分析

定量分析原理參見(jiàn)GB/T 19267.3和《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）（四部）0405熒光分光光度法，包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

注：在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)考慮內(nèi)濾效應(yīng)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。

2熒光量子產(chǎn)率分析原理

熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定有參比法和絕對(duì)法兩種。

2.1參比法

也稱(chēng)相對(duì)法，是用已知量子產(chǎn)率的熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參比對(duì)待測(cè)熒光試樣進(jìn)行量子產(chǎn)率的測(cè)試。在相同激發(fā)條件下，分別測(cè)定待測(cè)熒光試樣和參比熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兩種稀溶液的積分熒光強(qiáng)度（即校正熒光光譜所包括的面積），以及對(duì)該激發(fā)波長(zhǎng)人射光的吸光度，再將這些值分別代入公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

?

?

?

2.2絕對(duì)法

采用積分球?qū)晒饬孔赢a(chǎn)率進(jìn)行測(cè)量，適用于液體、固體、薄膜和粉末樣品，目前一般測(cè)試波長(zhǎng)范圍為300 nm~800nm。待測(cè)樣品各個(gè)方向的發(fā)射光經(jīng)過(guò)積分球均勻化后從出射口出來(lái)，并經(jīng)過(guò)單色器最后被檢測(cè)器所檢測(cè)。測(cè)定時(shí)，分別測(cè)定待測(cè)熒光試樣和空白試樣的熒光峰面積和激發(fā)峰面積（均為校正后）再將這些值分別代入公式（2）進(jìn)行計(jì)算：

?

?

?

3熒光偏振分析原理

熒光偏振（P）和熒光各向異性（r）定義為公式（3）和公式（4）。

?

?

?

4熒光壽命分析原理

熒光壽命的測(cè)試一般采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法（time correlated single photon counting），簡(jiǎn)稱(chēng)“TCSPC法”；或相調(diào)制技術(shù)，也稱(chēng)為“頻域法（frequency-domain method）”；或頻閃分時(shí)法，簡(jiǎn)稱(chēng)"STROBE”法。TCSPC、頻域法和STROBE的具體原理參見(jiàn)附錄A。在當(dāng)今實(shí)際應(yīng)用中，TCSPC法和STROBE 方法互為補(bǔ)充。

5時(shí)間分辨熒光光譜分析原理

獲得時(shí)間分辨激發(fā)/發(fā)射光譜（time-resolved excitation/emission spectra，TRES）的常用技術(shù)有；采用多波長(zhǎng)掃描獲得一系列的衰減曲線，而后對(duì)應(yīng)特定時(shí)間寬度做時(shí)間切片后，獲得時(shí)間分辨激發(fā)/發(fā)射光譜；對(duì)應(yīng)的測(cè)試技術(shù)有boxcar（取樣積分技術(shù)）、TCSPC等；直接測(cè)量方法，采用可以采集光譜的多道檢測(cè)器，比如 ICCD（intensified charge-coupled device）、條紋相機(jī)、微通道板（multiple channel tube，MCP）等，經(jīng)過(guò)光譜儀色散后，直接獲得一系列設(shè)定時(shí)間寬度的瞬時(shí)光譜。

?